紅細(xì)胞壽命是指紅細(xì)胞在循環(huán)血液中的存活時間。正常人紅細(xì)胞壽命為70~140 d，平均為115 d^[1,2]，衰老紅細(xì)胞由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非隨機(jī)清除。重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）包括紅細(xì)胞在內(nèi)的三系血細(xì)胞絕對數(shù)量的減少源于極度的骨髓造血衰竭^[3]，而其成熟紅細(xì)胞壽命是否改變以及免疫抑制治療（IST）對紅細(xì)胞壽命有何影響卻少有報道。本研究中，我們采用無創(chuàng)測定內(nèi)源性一氧化碳（CO）的呼氣試驗對51例初診未治和77例免疫抑制治療（IST）后的SAA/VSAA患者的紅細(xì)胞壽命進(jìn)行了檢測，現(xiàn)報道如下。

病例與方法

1.　病例：

以2016年11月至2017年4月于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院貧血診療中心就診的128例SAA/VSAA患者為研究對象，男80例，女48例，中位年齡23（6~66）歲。AA診斷參照國際粒細(xì)胞減少與AA研究組1987年標(biāo)準(zhǔn)^[4]，嚴(yán)重程度分型參照Camitta等1976年標(biāo)準(zhǔn)^[5]和Bacigalupo等1988年標(biāo)準(zhǔn)^[6]。肝炎相關(guān)性AA（HAAA）定義為與肝炎同時或在肝炎患病6個月內(nèi)發(fā)生的AA，血清轉(zhuǎn)氨酶水平至少達(dá)200 U/L^[7]。患者治療前均明確診斷及分型，并經(jīng)仔細(xì)詢問病史、查體、常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢查、Ham試驗及流式細(xì)胞術(shù)檢測嗜水氣單胞菌溶素變異體（Flaer）表達(dá)排除低增生性骨髓增生異常綜合征（MDS）及陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）。40歲以下患者常規(guī)進(jìn)行彗星試驗、絲裂霉素試驗等除外先天性骨髓造血衰竭。51例為初診未治且未接受紅細(xì)胞輸注患者，為初診組；77例為IST后至少6個月、可評價IST療效的患者，為IST組。

以13例健康志愿者為正常對照，男3例，女10例，中位年齡36（28~47）歲，中位HGB 134（117~158）g/L。

2.　紅細(xì)胞壽命測定：

采用測定內(nèi)源性CO呼氣試驗方法檢測紅細(xì)胞壽命，RBCS-01型紅細(xì)胞壽命測定儀為深圳先亞生物科技有限公司產(chǎn)品。采氣時間限定在8∶00至12∶00，采氣前24 h內(nèi)禁止受檢者吸煙，采氣時受檢者保持空腹、靜息狀態(tài)。采氣流程：受檢者首先深吸氣，屏氣20 s，隨之含住密封鋁箔肺泡氣收集袋的單向?qū)夤懿⑸詈魵?；收納受檢者呼出氣的同時以手動氣泵采集同室空氣樣本，上機(jī)測定CO濃度，并計算紅細(xì)胞壽命。

3.　細(xì)胞因子測定：

取SAA/VSAA患者外周血5 ml，應(yīng)用固相、夾心法化學(xué)發(fā)光免疫法檢測IL-2受體（IL-2R）、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平，試劑盒購自德國西門子公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

4.　治療方法：

初診組患者檢測紅細(xì)胞壽命前未接受任何治療。IST組患者治療方法包括：兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白（r-ATG）+環(huán)孢素A（CsA）治療6例（7.8%），豬抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白（p-ALG）+CsA治療67例（87.0%），環(huán)磷酰胺（CTX）+CsA治療1例（1.3%），單用CsA治療3例（3.9%）。具體用法：r-ATG 3.5 mg·kg^-1·d^-1，靜脈滴注，第1~5天；p-ALG 20 mg·kg^-1·d^-1，靜脈滴注，第1~5天；CTX 30 mg·kg^-1·d^-1，靜脈滴注，第1~4天；CsA以3 mg·kg^-1·d^-1分2次口服起始，ATG/ALG輸注結(jié)束后第1天開始，維持CsA血清谷濃度150~250 μg/L。獲得治療反應(yīng)前予G-CSF、紅細(xì)胞輸注及血小板輸注等支持治療，紅細(xì)胞壽命測定時間與末次輸血時間至少間隔2周。

5.　療效判定及隨訪：

療效評定參照英國血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會標(biāo)準(zhǔn)修訂，并增加良好部分治療反應(yīng)（GPR）標(biāo)準(zhǔn)，具體參照文獻(xiàn)[8]。完全治療反應(yīng)（CR）、GPR、部分治療反應(yīng)（PR）均為獲得治療反應(yīng)（HR）。IST后每3個月進(jìn)行血細(xì)胞分析、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查及外周血細(xì)胞錨連蛋白等檢測評定療效，隨訪截至2017年10月1日。

6.　統(tǒng)計學(xué)處理：

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。一氧化碳濃度及紅細(xì)胞壽命以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行組間比較。其他連續(xù)變量以中位數(shù)（范圍）表示，采用Mann-Whitney U檢驗進(jìn)行組間比較。分類變量采用卡方檢驗或Fisher精確概率法進(jìn)行比較。采用Spearman相關(guān)分析比較細(xì)胞因子與紅細(xì)胞壽命的相關(guān)性。應(yīng)用ROC曲線探索初診患者紅細(xì)胞壽命預(yù)測IST治療反應(yīng)的界值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.　患者一般臨床特征：

128例SAA/VSAA患者中，男80例，女48例，中位年齡23（6~66）歲。初診組51例、IST組77例。77例IST組患者療效反應(yīng)：CR 40例（51.9%）、GPR 11例（14.3%）、PR 17例（22.1%）、未獲得治療反應(yīng)（NR）9例（11.7%）。兩組患者一般臨床特征比較見表1。

表1

128例重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）患者一般臨床特征

2.　初診SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命：

見表2。未經(jīng)輸血支持的51例初診SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命為（50.69±21.43）d，與正常對照紅細(xì)胞壽命[（111.85±31.55）d]相比較明顯縮短（t=-6.611，P<0.001）。中位縮短61.20（50.69~111.85）d，約為正常對照紅細(xì)胞壽命的45.3%。

表2

初診及免疫抑制治療（IST）后重型/極重型再生障礙性貧血患者紅細(xì)胞壽命比較（±s）

3．IST對SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命的影響：

77例IST組患者紅細(xì)胞壽命為（87.14±39.28）d。HR患者紅細(xì)胞壽命為（92.00±38.60）d，較初診組患者明顯延長（t=7.430，P<0.001），而與正常對照組相近（t=-1.743，P=0.085）；其中CR者紅細(xì)胞壽命為（106.15±32.12）d，與正常對照者一致（t=-0.558，P=0.579）；GPR者為（74.09±39.19）d，PR者為（70.29±39.28）d，分別較初診患者紅細(xì)胞壽命延長23.4 d和19.6 d；未獲得治療反應(yīng)（NR）患者紅細(xì)胞壽命為（50.44±21.56）d，與初診患者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.032，P=0.975），與HR患者相比則明顯縮短（t=-4.846，P=0.002）（表2）。

4．SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命縮短的原因：

單因素分析結(jié)果見表3。初診組51例患者性別（男/女）、年齡（≤14歲/>14歲）、病因（HAAA/原發(fā)性AA）、嚴(yán)重程度分型（SAA/VSAA）、外周血細(xì)胞參數(shù)及是否伴發(fā)PNH克隆等因素對紅細(xì)胞壽命均無明顯影響。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，初診SAA/VSAA患者血清IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子水平與紅細(xì)胞壽命均無明顯相關(guān)性（r_s分別為-0.183、-0.132、0.085、0.183、-0.011，P值分別為0.213、0.372、0.565、0.213、0.943）。

表3

影響初診重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）患者紅細(xì)胞壽命的單因素分析（±s）

5．HR與否血清細(xì)胞因子水平比較：

見表4，HR的68例較NR的9例患者血清IL-2R和IL-6水平明顯減低（P值均<0.05），IL-8、IL-10和TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均>0.05）。

表4

重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）患者免疫抑制治療獲得治療反應(yīng)與否血清細(xì)胞因子水平比較[M（范圍）]

6.　治療前患者紅細(xì)胞壽命與IST療效的關(guān)系：

初診組51例患者中38例后續(xù)接受IST并評價3個月療效，其中HR 16例（42.1%），NR 22例（57.9%）。應(yīng)用ROC曲線分析治療前患者紅細(xì)胞壽命不同界值對IST療效的預(yù)測作用，其cut-off值為60 d，曲線下面積為0.693（95%CI 0.525~0.861，P=0.044），陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為66.7%和65.6%，敏感性和特異性分別為37.5%和86.4%。38例患者中9例治療前紅細(xì)胞壽命>60 d，IST后3個月HR 6例，NR 3例；29例治療前紅細(xì)胞壽命≤60 d，IST后3個月HR 10例，NR 19例，兩組構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.128）。

討論

除了由于血小板明顯減少可能合并出血外，AA患者貧血的發(fā)生通常被認(rèn)為緣于殘存造血細(xì)胞減少，骨髓造血衰竭。本研究我們采用檢測內(nèi)源性CO生成的呼氣試驗研究初診和IST后獲得不同血液學(xué)反應(yīng)的SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命，結(jié)果表明初診SAA/VSAA患者殘存造血生成的紅細(xì)胞壽命明顯縮短，IST后6個月HR者紅細(xì)胞壽命可恢復(fù)正常。本研究我們首次詳細(xì)報道了SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命和IST療效的關(guān)系，有助于更為詳盡理解SAA/VSAA病理生理機(jī)制和紅細(xì)胞動力學(xué)變化。

早在1918年Ashby就通過差異凝集實驗發(fā)現(xiàn)正常人紅細(xì)胞壽命約為120 d^[9]。此后，多種的紅細(xì)胞壽命測定方法陸續(xù)研發(fā)，包括15N-甘氨酸^[10]、⁵¹Cr^[11]、生物素^[12]等紅細(xì)胞標(biāo)記直接測定法，根據(jù)血紅蛋白更新速率測算的CO呼氣試驗^[13,14]及基于網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對值的紅細(xì)胞壽命快速測算方法^[15]等間接測定法。這些不同方法測定或推定的正常人紅細(xì)胞壽命與Ashby結(jié)果相似。然而，除CO呼氣試驗外，其他方法測定紅細(xì)胞壽命多耗時長、需多次采集血液樣本、含有放射性同位素以及基于機(jī)體生理狀況和骨髓造血長時間穩(wěn)定計算，因此難以適用于包括SAA在內(nèi)的急性、重癥疾病患者。CO呼氣試驗無創(chuàng)、快捷、經(jīng)濟(jì)、與紅細(xì)胞標(biāo)記法結(jié)果高度吻合^[14]，可滿足不同生理和病理狀態(tài)下紅細(xì)胞壽命測定，本研究我們即采用該方法進(jìn)行紅細(xì)胞壽命檢測。

文獻(xiàn)報道顯示，采用⁵¹Cr標(biāo)記法在慢性再生障礙性貧血（CAA）患者中測得的紅細(xì)胞半壽期均較正常對照縮短^[16,17,18]，大多輕度縮短，少數(shù)患者紅細(xì)胞半壽期正常。迄今尚缺乏SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命相關(guān)研究資料。本研究顯示，在初診未輸血的SAA/VSAA患者中，紅細(xì)胞壽命為（50.69±21.43）d，較正常對照[（111.85±31.55）d]明顯縮短（t=-6.611，P<0.001），中位縮短61.20（50.69~111.85）d，約為正常對照紅細(xì)胞壽命的45.3%。該結(jié)果與前期文獻(xiàn)報告AA患者紅細(xì)胞半壽期縮短結(jié)果相一致，而壽命縮短程度似乎更為明顯。鑒于本研究納入患者均為初診SAA/VSAA，且采用與以往不同的檢測方法，其紅細(xì)胞壽命是否確實較非重型AA患者者更短需應(yīng)用相同檢測方法納入不同患者進(jìn)一步驗證。

我們對51例初診SAA/VSAA患者疾病特征與紅細(xì)胞壽命的關(guān)系進(jìn)行了研究，對包括人口學(xué)和血液學(xué)多種參數(shù)進(jìn)行單因素分析，未發(fā)現(xiàn)與紅細(xì)胞壽命相關(guān)的變量。提示初診SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命縮短可能與AA基本病理生理過程相關(guān)，為疾病本身特征性改變，與性別、年齡、病因等因素?zé)o關(guān)。而從屬于疾病嚴(yán)重程度、微小PNH克隆等特性之間紅細(xì)胞壽命亦無差異，可能與納入患者相對均一和樣本量較小有關(guān)。ROC曲線分析顯示紅細(xì)胞壽命與IST療效預(yù)測作用界值為60 d，敏感性和特異性分別為37.5%和86.4%。以治療前紅細(xì)胞壽命60 d為分界比較不同紅細(xì)胞壽命分組對IST后3個月療效影響，9例治療前紅細(xì)胞壽命>60 d，IST后3個月HR 6例，NR 3例；29例紅細(xì)胞壽命≤60 d，IST后3個月HR 10例，NR 19例（P=0.128）?？赡芘c樣本量較小相關(guān)，宜進(jìn)一步增加樣本量驗證治療前紅細(xì)胞壽命是否可預(yù)測IST療效。

AA患者紅細(xì)胞壽命縮短的機(jī)制不清。研究顯示，CAA紅細(xì)胞壽命縮短與紅細(xì)胞在脾臟破壞過多^[17]及紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)在質(zhì)量、膜蛋白的含量、分布改變繼而使紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、形態(tài)和變形性改變，導(dǎo)致紅細(xì)胞壽命縮短直接相關(guān)^[19]。本研究結(jié)果顯示，IST后HR患者較NR患者血清IL-2R和IL-6水平明顯減低。提示紅細(xì)胞壽命可能與淋巴細(xì)胞因子水平異常改變有關(guān)，這與慢性病貧血炎性細(xì)胞因子增多引致紅細(xì)胞壽命縮短機(jī)制相一致。Gardenghi等^[20]研究發(fā)現(xiàn)，在熱殺傷布氏桿菌誘導(dǎo)的炎性貧血小鼠模型，單核巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞現(xiàn)象較正常對照小鼠明顯常見，以脾臟噬血細(xì)胞現(xiàn)象表現(xiàn)最為明顯。在其他許多類型的炎性狀態(tài)下也都觀察到這種單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬紅細(xì)胞現(xiàn)象增加、紅細(xì)胞壽命縮短^[21,22]。細(xì)胞因子激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使紅細(xì)胞被過多吞噬、分解，紅細(xì)胞壽命可縮短40%，被認(rèn)為與炎性貧血的發(fā)生有關(guān)^[21,23]。我們認(rèn)為AA是兼有炎性貧血特征的骨髓造血衰竭，其貧血的發(fā)生是以骨髓紅系造血減少為基本改變、紅細(xì)胞壽命縮短參與共同作用的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，IST后HR患者除外周血三系血細(xì)胞參數(shù)明顯升高提示恢復(fù)自身骨髓造血外，隨著多種細(xì)胞因子水平下降紅細(xì)胞壽命也明顯延長或恢復(fù)正常，支持這種假設(shè)。

IST后SAA/VSAA患者紅細(xì)胞壽命可改善或恢復(fù)正常，表明AA殘存造血干祖細(xì)胞所生成的紅細(xì)胞內(nèi)在質(zhì)量并無明顯異常。在本研究中，HR患者紅細(xì)胞壽命和IL-6等細(xì)胞因子水平都較NR患者明顯改善。并且療效質(zhì)量與紅細(xì)胞壽命改善程度相關(guān)，獲得CR者紅細(xì)胞壽命恢復(fù)正常，GPR者明顯改善，而NR者與初診患者一致，仍明顯縮短。提示在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)治療方案下，SAA/VSAA患者IST療效的獲得可能與病患個體異常免疫能否得以有效控制相關(guān)。鑒于紅細(xì)胞壽命縮短與炎性細(xì)胞因子激活單核巨噬細(xì)胞有關(guān)，因而，檢測這一參數(shù)IST前后變化可能反映AA異常免疫是否得以控制。

總之，以內(nèi)源性CO的呼氣試驗方法研究紅細(xì)胞壽命結(jié)果表明，AA患者紅細(xì)胞壽命縮短，經(jīng)IST可改善或恢復(fù)正常；淋巴細(xì)胞因子水平升高可能與AA紅細(xì)胞壽命縮短有關(guān)。AA是兼有炎性貧血特征的骨髓造血衰竭。

參考文獻(xiàn)

[1] CohenRM,FrancoRS,KheraPK, et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c[J]. Blood, 2008, 112（10）:4284-4291. DOI: 10.1182/blood-2008-04-154112.

[2] MockDM,MatthewsNI,ZhuS, et al. Red blood cell（RBC）survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities[J]. Transfusion, 2011, 51（5）:1047-1057. DOI: 10.1111/j.1537-2995.2010.02926.x.

[3] YoungNS,CaladoRT,ScheinbergP. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia[J]. Blood, 2006, 108（8）:2509-2519. DOI: 10.1182/blood-2006-03-010777.

[4] [No authors listed]. Incidence of aplastic anemia: the relevance of diagnostic criteria. By the International Agranulocytosis and Aplastic Anemia Study[J]. Blood, 1987, 70（6）:1718-1721.

[5] CamittaBM,ThomasED,NathanDG, et al. Severe aplastic anemia: a prospective study of the effect of early marrow transplantation on acute mortality[J]. Blood, 1976, 48（1）:63-70.

[6] BacigalupoA,HowsJ,GluckmanE, et al. Bone marrow transplantation（BMT）versus immunosuppression for the treatment of severe aplastic anaemia（SAA）: a report of the EBMT SAA working party[J]. Br J Haematol, 1988, 70（2）:177-182.

[7] BaumelouE,GuiguetM,MaryJY. Epidemiology of aplastic anemia in France: a case-control study. I. Medical history and medication use. The French Cooperative Group for Epidemiological Study of Aplastic Anemia[J]. Blood, 1993, 81（6）:1471-1478.

[8] 劉麗媛,王慧君,張莉,等.一線應(yīng)用兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白聯(lián)合環(huán)孢素治療兒童重型再生障礙性貧血[J].中華血液學(xué)雜志, 2009, 30（11）:749-753. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2009.11.008.

[9] AshbyW. The span of life of the red blood cell; a resume[J]. Blood, 1948, 3（5）:486-500.

[10] SheminD,RittenbergD. The life span of the human red blood cell[J]. J Biol Chem, 1946,166（2）:627-636.

[11] RogersSE,EdmondsonD,GoodrickMJ, et al. Prestorage white cell reduction in saline-adenine-glucose-mannitol red cells by use of an integral filter: evaluation of storage values and invivo recovery[J].Transfusion, 1995, 35（9）:727-733.

[12] MockDM,LankfordGL,MatthewsNI, et al. Accelerated removal of antibody-coated red blood cells from the circulation is accurately tracked by a biotin label[J]. Transfusion, 2012, 52（5）:1097-1105. DOI:10.1111/j.1537-2995.2011.03397.x.

[13] CoburnRF,WilliamsWJ,KahnSB. Endogenous carbon monoxide production in patients with hemolytic anemia[J]. J Clin Invest, 1966, 45（4）:460-468. DOI: 10.1172/JCI105360.

[14] MaYJ,ZhangHD,JiYQ, et al. A modified carbon monoxide breath test for measuring erythrocyte lifespan in small animals[J]. Biomed Res Int, 2016, 2016:7173156. DOI: 10.1155/2016/7173156.

[15] KrzyzanskiW,BrierME,CreedTM, et al. Reticulocyte-based estimation of red blood cell lifespan[J]. Exp Hematol, 2013, 41（9）:817-822. DOI: 10.1016/j.exphem.2013.05.001.

[16] RakhmatullaevAR,KaritskaiaGK.[Erythrocyte longevity in hypoplastic anemia patients undergoing splenectomy as part of combined treatment][J]. Ter Arkh, 1987, 59（9）:98-101.

[17] 劉訪杰,瞿全,趙艷津.再生障礙性貧血患者切脾治療前后的紅細(xì)胞壽命的觀察[J].臨床血液學(xué)雜志, 1993,6（3）:117-119.

[18] 張之南,鄭慶棠,周前,等. 51Cr標(biāo)記法測定紅細(xì)胞壽命的臨床應(yīng)用[J].中華血液學(xué)雜志, 1987, 8（12）: 729-731.

[19] 張圣明,李建華,李廣宙,等.慢性再生障礙性貧血患者紅細(xì)胞壽命測定及膜蛋白的形態(tài)學(xué)觀察[J].濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1996, 18（1）:1-4.

[20] GardenghiS,RenaudTM,MeloniA, et al. Distinct roles for hepcidin and interleukin-6 in the recovery from anemia in mice injected with heat-killed Brucella abortus[J]. Blood, 2014, 123（8）:1137-1145.DOI: 10.1182/blood-2013-08-521625.

[21] ZollerEE,LykensJE,TerrellCE, et al. Hemophagocytosis causes a consumptive anemia of inflammation[J]. J Exp Med, 2011, 208（6）:1203-1214. DOI: 10.1084/jem.20102538.

[22] MitlyngBL,SinghJA,FurneJK, et al. Use of breath carbon monoxide measurements to assess erythrocyte survival in subjects with chronic diseases[J]. Am J Hematol, 2006, 81（6）:432-438.

[23] KimA,FungE,ParikhSG, et al. A mouse model of anemia of inflammation: complex pathogenesis with partial dependence on hepcidin[J]. Blood, 2014, 123（8）:1129-1136. DOI: 10.1182/blood-2013-08-